酱油涨袋、涨瓶中产气菌的检测探讨
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酱油涨袋、涨瓶中产气菌的检测探讨
樊君,  罗红刚,  王惠芳,  周红梅
(四川省调味品添加剂工程技术研究中心,四川 眉山 620010)
摘  要:叙述了对酱油涨袋、涨瓶中产气菌的检测方法,通过不同培养基和判定方法,可预测产品是否会出现货架期涨袋、涨瓶现象,经生产企业实践证明,杜绝了酱油产气的质量问题。具有一定的实用价值。
关  键  词:酱油;产气菌;涨袋;涨瓶
Detectionofsoy sauce bottle up bag, up gas producing bacteria
FAN Jun, LUO Hong-gang, WANG Hui-fang, ZHOU Hong-mei
(Sichuan Province flavoring additives engineering technology research center of Sichuan, Meishan 620010,China)
Abstract: The detection method of soy sauce bottle up bag, rose aerogen, through different media and the determination method, can predict the product whether there will be ashelf up bag, up the bottle, certified productionen terprise practice, to eliminate thequality problems of gas production of soy sauce. It has certain practical value.
Key words: soy sauce;gas bottle explosion rose bag; rose bottle
酱油是以大豆、小麦等为原料,经原料预处理、制曲、发酵、压榨取油及精制杀菌等工艺生产出来的调味品,营养极其丰富,主要营养成份包括氨基酸、可溶性蛋白质、糖类、酸类等。这些营养极易被各种菌利用,特别是产气菌在夏季气温高的时候极易发生,产品虽然在灌装之前已通过了灭菌,其卫生指标也符合了酿造酱油国家卫生标准,但还残留了一些微生物,特别是产气杂菌,对产品的保质期影响巨大。针对客户反映的事故产品即涨袋、涨瓶酱油的微生物检验和进行菌学分析,发现酱油在不同的培养基上出现了菌落总数中从未有过的新形态特征菌落,由此进行了分离、培养和鉴定,并探讨通过酱油微生物菌落不同形态以及在不同培养基条件下的反应特征来判定和产气检验,使产品在灌装入库前的质量可得到有效控制,从而杜绝产品在存放或货架期出现涨袋、涨瓶的现象,实践证明,有较好的实用价值和可操作性。
1  材料和方法
1.1材料
药品和原料:蛋白胨,酵母膏 ,葡萄糖,胰蛋白胨,酵母浸膏,葡萄糖,琼脂,土豆。
设备:灭菌锅,显微镜,超净工作台等。
试剂:甲基红指示剂
1.2方法
1.2.1液体培养基配比(代号Y1):蛋白胨10g ,酵母膏5g ,葡萄糖1g ,蒸馏水1000ml,PH自然(5.2±0.2)
1.2.1.1配制方法:称取上述成分,加入蒸馏水中搅拌溶解后,定容到1000ml,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管27ml,包扎,0.1MPa121℃恒温灭菌15min。
1.2.1.2接种培养:空白样1根试管,每个检测样9根试管。另取装有5—6粒玻璃珠的300
—500ml无菌三角瓶,加入待测样100—250ml充分振荡摇匀,向装有27ml培养基的每根试管中接入3ml待测原样,摇匀后于36℃培养48h。
1.2.1.3培养观察
培养48h,沿试管壁缓慢加入甲基红指示剂,仔细观察培养液上层,注意不要摇动试管,若培养液上层变为黄色,则有产气菌;培养48h,沿试管壁缓慢加入甲基红指示剂,仔细观察培养液上层,注意不要摇动试管,若培养液上层变为红色且倒管内无气泡,则无产气菌;培养48h,倒管内有小气泡,则有产气菌。
1.2.1.4判定
检测样倒管3/9产气(计数方法同大肠菌群的计数法),无论检测样表面有无菌膜,该批样均可判定为产气样;检测样8/9长菌膜,8/9菌膜厚度1mm,且加入甲基红8/9变红,倒管无气泡,该批样均可判定为产气样。
1.2.2固体培养基
1.2.2.1培养基配比(代号Y2):胰蛋白胨5.0g,酵母浸膏2.5g,葡萄糖1.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,PH7.0±0.2
1.2.2.2分装灭菌:称取上述培养基组分,加水溶解(琼脂加入三角瓶)并定容到1000ml,分装到300—500ml三角瓶中,0.1MPa121℃恒温灭菌30min。待培养基温度降至40—45℃时倒入无菌培养皿中,待用。
1.2.2.3接种培养:将待测样或梯度稀释样,接种到培养皿上,于36℃恒温培养48h,观察培养皿上菌落特征,并做镜检。
1.3涨袋、涨瓶酱油中检测到的几种产气菌的菌落特征
1.3.1产气菌M1菌落特征:菌落大、灰白色、不规则、不透明、皱褶、生长在培养基里面,中间有一小液泡凸起,继而瘪缩(见下面M1菌落图片);镜检特征:芽孢杆菌;液体培养特征:试管液面长菌膜(菌膜灰白色、有皱褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉时液体浑浊);加入甲基红液面呈黄色;有时菌膜处现气泡,但倒管无气泡。

1.3.2产气菌M2菌落特征:菌落大、白色、树根状、不透明、皱褶、生长在培养基表面,象松花皮蛋的松花状,继续培养长成树根状(见下面M2菌落图片)。镜检特征:芽孢杆菌;液体培养特征:试管液面长菌膜(菌膜灰白色、有皱褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉时液体浑浊);加入甲基红液面呈黄色;有时菌膜处现气泡,但倒管无气泡。

1.3.3产气菌M3菌落特征:菌落大、不规则、不透明、皱褶、生长在培养基表面,中心有粉红色圆点,整个菌落略显粉红色见下面M3菌落图片);镜检特征:芽孢杆菌;液体培养特征:试管液面长菌膜(菌膜灰白色、有皱褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉时液体浑浊);加入甲基红液面呈黄色;有时菌膜处现气泡,但倒管无气泡。

1.3.4产气菌M5菌落特征:菌落小、不规则、不透明、乳白色、生长在培养基内部,继续培养长出培养基表面(见下面M5图片)。镜检特征:芽孢杆菌;液体培养特征:试管液面长菌膜(菌膜灰白色、有皱褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉时液体浑浊);加入甲基红液面呈黄色;有时菌膜处现气泡,但倒管无气泡。

1.3.5产气菌M6菌落特征:菌落大、不规则、不透明、白色、扁平一片、生长在培养基与平皿之间,继续培养长出培养基表面(见下面M6菌落图片)。镜检特征:芽孢杆菌;液体培养特征:试管液面长菌膜(菌膜灰白色、有皱褶),下面清澈(但形成菌膜之前或菌膜下沉时液体浑浊);加入甲基红液面呈黄色;有时菌膜处现气泡,但倒管无气泡。

1.3.6产气菌M7菌落特征:菌落大小适中、透明、白色、圆形、凸起、生长在培养基表面(见下面M7菌落图片)。

镜检特征:非芽孢杆菌,短杆菌(镜检图片如下)。

液体培养特征:试管液面无菌膜;加入甲基红液面呈红色;倒管有气泡。

1.4液体培养基配比(代号Y3):土豆(去皮切块)300g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml,PH自然(4.5-5.0)
1.4.1制备方法:称取去皮切块的土豆,加水1000ml,煮沸维持10-20min,用多层纱布过滤,滤液加水定容到1000ml,加入葡萄糖搅拌溶解,试管内放入倒置的小倒管,然后分装,每管27ml,包扎,0.1MPa121℃恒温灭菌20min。
1.4.2接种培养:空白样1根试管,每个检测样9根试管。取装有5—6粒玻璃珠的300—500ml无菌三角瓶,加入待测样100—250ml充分振荡摇匀,向装有27ml培养基的每根试管中接入3ml待测原样,摇匀后于36℃培养72h或最好30℃培养5d。
1.4.3观察记录:培养3-5d,如倒管有气泡,则判断有产气菌。
1.4.4判定:空白样管倒管无气泡,检测样倒管3/9产气(参考GB大肠菌群计数法),无论检测样表面有无菌膜,均判定为有酵母菌。
1.5固体培养基配制(代号Y4):土豆(去皮切块)300g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,PH自然(4.5-5.0)
1.5.1制备方法:称取去皮切块的土豆,加水1000ml,煮沸维持10-20min,用多层纱布过滤,滤液加水定容到1000ml,加入葡萄糖搅拌溶解,调PH4.5-5.0(琼脂加入三角瓶中)。
1.5.2分装灭菌:称取上述培养基分装到300—500ml三角瓶,于0.1MPa121℃恒温灭菌30min。待培养基温度降至40-45℃时倒入无菌培养皿中,并做镜检。
1.5.3接种培养:将待测样或梯度稀释样,接种到培养皿上,于36℃培养72h或最好30℃培养5d,观察培养皿上菌落特征,并做镜检。
1.6产气菌M8菌落特征:菌落直径小、白色、先生长在培养基中间继而长出表面,有皱褶(见下面M8菌落图片);镜检特征:椭圆形、腊肠型(镜检图片如下);液体培养特征:液面有菌膜,倒管有气泡。

1.7产气菌M9菌落特征:菌落直径中、白色、生长在培养基表面,近圆形菌落中心有小凸起,培养时间越长皱褶越明显(见下面M9菌落图片)。镜检特征:多为腊肠型;液体培养特征:液面有菌膜,倒管有气泡;镜检特征:多为腊肠型;液体培养特征:液面有菌膜,倒管有气泡。

1.8产气菌M10菌落特征:菌落直径中、白色、生长在培养基表面,近圆形凸起菌落上载有一小凸起,一开始皱褶明显(见下面M10菌落图片)。

镜检特征:椭圆形,腊肠形;液体培养特征:液面有菌膜,倒管有气泡;

1.9产气细长杆菌M11菌落特征:菌落直径大、灰白色、边缘不整齐、有皱褶(见下面M11菌落图片)。

镜检特征:棒杆状,腊肠形(镜检图片如下)。液面有菌膜,倒管有气泡。

2  结果与分析

2.1不同细菌分解利用糖的能力不同,有的能利用,有的不能利用,能利用者,有的产酸又产气,有的只产酸不产气。因此,细菌能否利用糖以及利用糖表现出是否产酸产气作为细菌分类鉴定的依据。观察是否产酸可在发酵培养基中加入指示剂溴甲酚绿(PH值在5.2以下呈黄色,PH值在6.8以上呈紫色),培养后根据指示剂的颜色变化来判断。
2.2 对于兼氧型的产气细菌,培养过程在液体里面生长繁殖,产气的气体会进入倒管,因此,观察是否产气可在发酵培养基中倒置放入杜氏小管,培养后观察倒置小管中有无气泡。
2.3 对于好氧型的产气菌,培养过程在液体培养基的表面或上部生长繁殖,产气的气体不会进入倒管。这类产气菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醚、气体和水等),培养基的酸度在PH6.2以上,加入甲基红指示剂呈黄色,因此观察培养基的变色情况来作为判定产气菌的依据。甲基红为酸性指示剂,PH范围4.4—6.0,在PH5.0以下,随酸度而增强红色,在PH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在PH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。
3  结论
用Y1液体培养基和Y2固体培养基均可检测和判断酱油涨袋、涨瓶的细菌型产气菌,M1-M6菌均为芽孢杆菌,甲基红实验呈黄色,倒管无气泡;M7为非芽孢杆菌,甲基红实验呈红色,倒管有气泡。用Y2液体培养基和Y4固体培养基均可检测和判断酱油涨袋、涨瓶中的酵母菌和细长细菌产气菌,M8-M10菌为酵母菌,M11为细长细菌。在实际应用中,如果产品中检出此类菌,均有涨袋、涨瓶风险。在生产中,对前期酱油在灌装入库时进行抽测,可以很好的预判酱油的货架期,减少经济损失。



参考文献:
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